По словам директора учреждения Светланы Сединко, это единственное на юге России музейное здание, построенное для хранения реликвий Войска Донского и материальных свидетельств истории донского казачества по проекту академика архитектуры А. А. Ященко.
Знаковым было место закладки сооружения для музея. Оно воздвигнуто в центре города, на пересечении Платовского проспекта и улицы Атаманской. Здесь с 1829 года находилась Атаманская канцелярия, где хранились самые ранние из экспонатов будущего музея. Это позволило зданию музея стать одним из символов города и не затеряться среди более высоких по этажности сооружений, занятых административными учреждениями. В собрании коллекций музея и организации его работы большую роль сыграл первый директор музея Х.И. Попов, донской историк и археолог, оставшийся в этой должности до конца 1920 года. Несмотря на социальные и политические потрясения начала XX века, музей жил. В нем был создан художественный отдел и скомплектованы художественные коллекции. Творческий подъем в музее наметился в конце 1930-х годов, когда стал вырабатываться его новый профиль.
В феврале 1941 года Новочеркасский музей стал музеем истории донского казачества. В период немецко-фашистской оккупации города сотрудники сохранили наиболее ценные предметы и коллекции. После освобождения Новочеркасска музей возобновил работу.
В 1946 году, по окончании Второй мировой войны, из Пражского национального музея в Музей истории донского казачества были возвращены 2726 предметов, вывезенных в 1920 году, что сделало возможным создание музея истории донского казачества не только по названию, но и по сути. В музей возвратились казачьи регалии и реликвии, которые были ему переданы через год после открытия по приказу военного министра А. Н. Куропаткина. Наиболее ценные: клейноды, жалованные Петром I, символы атаманской власти (насека, бунчук, пернач и значок (флаг) Войска Донского). Пернач и бунчук с золотым шаром были получены из рук царя в 1706 году, однако они пострадали при пожаре в 1744 году и были воспроизведены императрицей Елизаветой Петровной. У казаков вошло в обычай выносить клейноды на казачий круг и принимать присягу. После закладки новой столицы казачьи регалии были торжественно перенесены в Новочеркасск. Таким образом подчеркивалась преемственность старой и новой столицы казаков. До 1900 года клейноды хранились в особом помещении в здании войсковых присутственных мест. С 1900-го до 1919 года находились в экспозиции музея. В 2023 году была воссоздана эта традиция, в музее открылся зал регалий и реликвий донского казачества. Среди возвращенных предметов были и вещи прославленных донцов, прежде всего мемориальные предметы знаменитого вихрь-атамана Матвея Платова. В их числе 3 наградные сабли с ножнами, нагайка и высочайшие награды Войску Донскому времен атаманства Платова.
В середине 1940-х годов в музей была передана коллекция картин Н. Н. Дубовского, завещанная родному городу. Ранее фонды музея пополнились работами донского художника-пейзажиста И. И. Крылова. Сейчас музей — это комплекс памятников: Атаманский дворец, мемориальный дом-музей И. И. Крылова, мемориальный дом-музей М. Б. Грекова, церковь Рождества Пресвятой Богородицы (х. М. Мишкин). В собрании музея более 200 тыс. музейных предметов. Активно ведется работа по их сохранению и научно-просветительская деятельность. Ежегодно музей посещает 165 тыс. гостей.
